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AxyPrep 質(zhì)粒DNA小量試劑盒
本試劑盒采用改進(jìn)的SDS 堿裂解法，結(jié)合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA 的目的。適合于從1-4 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多至20 μg 高純的質(zhì)粒DNA，用于測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性?xún)?nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
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本試劑盒采用改進(jìn)的SDS 堿裂解法，結(jié)合DNA 制備膜選擇性地吸附DNA 的方法達(dá)到快速純化質(zhì)粒DNA 的目的。適合于從1-4 ml 細(xì)菌培養(yǎng)物中提取多至20 μg 高純的質(zhì)粒DNA，用于測(cè)序、體外轉(zhuǎn)錄與翻譯、限制性?xún)?nèi)切酶消化、細(xì)菌轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)
一、試劑盒組成、貯存、穩(wěn)定性
說(shuō)明書(shū)，耗材：DNA 制備管，2 ml 離心管，1.5 ml 離心管。
RNase A：50 mg/ml，室溫保存。
Buffer S1：細(xì)菌懸浮液。加入RNase A 后，4°C 貯存。
Buffer S2： 細(xì)菌裂解液，室溫密閉貯存。(若出現(xiàn)沉淀，應(yīng)于37°C 溫浴溶解并冷卻至室溫后再使用。）
Buffer S3：中和液，室溫密閉貯存。
Buffer W1：洗滌液，室溫密閉貯存。
Buffer W2 concentrate：去鹽液。使用前，根據(jù)瓶上數(shù)量加入乙醇，混合均勻，室溫密閉貯存。可用100%乙醇或95%乙醇。
Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室溫密閉貯存。
二、注意事項(xiàng)
Buffer S2、Buffer S3和Buffer W1含刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套和眼鏡，避免沾染皮膚、眼睛和衣服，謹(jǐn)防吸入口鼻。若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要立即用大量清水或生理鹽水沖洗，必要時(shí)尋求醫(yī)療咨詢(xún)。
三、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備
1. 第一次使用前，RNase A全部加入Buffer S1 中，4°C貯存。
2. 準(zhǔn)備無(wú)核酸和核酸酶污染的Tip頭、離心管。
3. 第一次使用前，Buffer W2 concentrate中加入指定體積的無(wú)水乙醇。
四、操作步驟
第一次使用時(shí)，將試劑盒攜帶的RNase A全部加入到Buffer S1 中，混合均勻，4°C保存。
1. 取1-4 ml 在LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌液（若使用豐富培養(yǎng)基，菌液體積應(yīng)減半或更少），12,000×g 離心1 min，棄盡上清。
2. 用250 μl 已加入RNase A 的Buffer S1 懸浮細(xì)菌沉淀，懸浮需均勻，不應(yīng)留有小的菌塊。
3. 加入250 μl Buffer S2，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6 次均勻使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步驟不宜超過(guò)5 min。
4. 加入350 μl Buffer S3，溫和并充分地上下翻轉(zhuǎn)混合6-8 次，12,000×g 離心10 min。
步驟5～7 可以選擇負(fù)壓法或離心法純化質(zhì)粒DNA。
A. 負(fù)壓法
5A. 將質(zhì)粒DNA 制備管插到負(fù)壓裝置的接口上。吸取步驟4 中的離心上清并轉(zhuǎn)移到制備管中，開(kāi)啟并調(diào)節(jié)負(fù)壓至-20-30 英寸汞柱，緩慢吸走管中溶液。
6A. 加500 μl Buffer W1，吸盡管中溶液。
7A. 加700 μl Buffer W2，吸盡管中溶液；以同樣的方法再用700 μl Buffer W2 洗滌一次。
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無(wú)水乙醇。
B. 離心法
5B. 吸取步驟4 中的離心上清并轉(zhuǎn)移到DNA 制備管（置于2 ml 離心管中），12,000×g 離心1 min。
6B. 將制備管置回離心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g 離心1 min，棄濾液。
7B. 將制備管置回離心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g 離心1 min， 棄濾液；以同樣的方法再用700 μl Buffer W2 洗滌一次。棄濾液。
* 確認(rèn)在Buffer W2 concentrate 中已按試劑瓶上的指定體積加入無(wú)水乙醇。
8. 將制備管置回2 ml 離心管中，12,000×g 離心1 min。
9. 將制備管移入新的1.5 ml 離心管中，在DNA 制備膜正中央加60-80 μl 水或Eluent，室溫靜置1 min。12,000×g 離心1 min。